Плазмидная днк

Плазмидная днк

Предложенные выше методы имеют ограничение: они годятся только для тех плазмидных ДНК, молекулярная масса которых не превышает 100-106. В то же время для ряда бактериальных систем известны большие плазмиды, такие, как вызывающие образование опухолей растений плазмиды Agrobacterium iumefaciens[ЗО], плазмиды, детерминирующие устойчивость к антибиотикам и относящиеся к группе несовместимости Н [12], плазмиды Pseudomonas pulida,ответственные за разрушение камфоры [2, 24], а также разнообразные F-фак- торы [22, 26, 27]. В последнее время разработано несколько методов, позволяющих наряду с плазмидами небольшого размера выделять и эти большие плазмиды [9, 14, 17, 30]. Созданы также методы, дающие возможность работать с очень маленькими объемами или даже с материалом единственной колонии [10].
Метод, описываемый ниже, недавно разработали Портной и Уайт (личное сообщение). Его преимущество заключается в малых рабочих объемах; к тому же ему присущи лучшие стороны ранее опубликованных мето-дик.
В этом методе используется та особенность плазмид- ной ДНК, что ее цепи не расходятся под воздействием щелочи. Когда клетки разрушают в щелочных условиях, выход плазмидной ДНК с большой молекулярной массой (до 350-106) улучшается. В настоящее время мы используем этот метод, ставший стандартным, для выявления плазмид в любой культуре бактерий.
Данный метод был успешно применен нами при выделении плазмид как из грамотрицательных бактерий (например, Agrobacterium tumefaciens, Yersinia entero- colitica, Salmonella typhi, Klebsiella sp., E. coli),так и из грамположительпых (например, Staphylococcus sp., и Streptococcus sp.). Как и при использовании других методов, мы заметили, что для морских вибрионов и для галофильных бактерий необходимы этапы промывки высококонцентрированными солевыми растворами (до 1 М NaCl).
Плазмидная ДНК, полученная этим методом даже из 2 мл культуры, практически не содержит хромосомной ДНК, и после проведения немногочисленных дополнительных этапов ее можно непосредственно использовать для анализа с помощью трех рестриктаз (разд.
. Целиком все операции метода с дополнениями проводят следующим образом.
Выращивают в течение ночи 2 мл культуры в соответствующей среде (например, в сердечно-мозговом бульоне) на качалке в пробирках высотой 120 мм с завинчивающимися крышками. Для последующей обработки используют выросшие клетки или получают из них популяцию в логарифмической фазе роста, для чего культуру разводят 1 : 20 в 2 мл свежей среды и инкубируют ее дополнительно в течение 2—3 ч. Клетки собирают центрифугированием в течение 10 мин в настольной центрифуге Sorvall при 2500 g.
Ресуспендируют клетки в 2 мл буфера ТЭ (0,05 М трис-НС1, 0,01 М ЭДТА, pH 8,0), повторяют центрифу-гирование и тщательно ресуспендируют клеточный оса-док в 40 мкл буфера ТЭ.
Не ранее чем за сутки готовят лизирующий буфер (4% ДСН в буфере ТЭ, pH 12,4). Важно точно измерить pH, так как при pH 12,5 происходит необратимая денатурация плазмидной ДНК. Наливают в 1,5-мл центрифужную пробирку (производятся фирмой Brinkmann Instruments; номер по каталогу 22-36-911-1) 0,6 мл ли- зирующего буфера, после чего пастеровской пипеткой вносят туда же 40 мкл клеточной суспензии. Суспензию хорошо перемешивают, не прибегая к помощи специальных перемешивающих устройств и избегая сильного взбалтывания. (Чтобы лишний раз не переносить ю/ль- туру, ее можно выращивать непосредственно в 1,5-мл центрифужной пробирке.)
Для полного лизиса клеток суспензию инкубируют в течение 20 мин при 37 °С.
Нейтрализуют раствор добавлением 30 мкл 2,0 М триса, pH 7,0. Перемешивают его, медленными движе-ниями переворачивая пробирку до тех пор, пока не ста-нет изменяться вязкость раствора.
Хромосомную ДНК осаждают внесением такого количества NaCl (около 0,24 мл 5 М NaCl), чтобы создать в растворе конечную концентрацию 1 М. Это делают очень быстро. Для полного осаждения хромосомной ДНК пробирку ставят в лед на 4 ч. Если обследуется большое число культур и не нужно заботиться об особой чистоте плазмид, это время можно сократить до 1 ч.
С помощью микроцентрифуги (например, модель Eppendorf 5412) за 10 мин осаждают посторонний ма-териал и переливают надосадочную жидкость в другую
мл пробирку (не следует стараться, чтобы на дне первой пробирки осталось как можно меньше жидко-сти) .
Для осаждения ДНК добавляют к надосадочной жидкости 0,55 мл изопропанола. После перемешивания пробирку оставляют при —20 °С на 30 мин.
ДНК осаждают центрифугированием в течение 3 мин на микроцентрифуге, надосадочную жидкость вы-ливают, пробирку в перевернутом положении ставят на бумажную салфетку и затем ее содержимое высушивают под вакуумом.
Осадок суспендируют в 30 мкл буфера ТЭН (0,05 М трис, 0,005 М ЭДТА, 0,05 М NaCl, pH 8,0). ДНК растворяется в течение ночи при 4 °С. Обычно при электрофорезе (100 В, 3 ч) 10 мкл этого раствора в 0,7%-ной агарозе с применением трис-боратной буферной системы получают хорошо видимые полосы ДНК.
Для анализа плазмидной ДНК рестриктазным расщеплением ее подвергают дальнейшей очистке (разд.
на следующих дополнительных этапах.
И. Полученный на 9-м этапе осадок суспендируют в 100 мкл 0,01 М триса, pH 8,0, добавляют 100 мкл фенола, насыщенного 0,01 М трисом, pH 8,0, хорошо перемешивают и добавляют 100 мкл хлороформа.
Разделяют водную и фенол-хлороформн^ю фазы центрифугированием в течение 30 с на микроцентрифуге. Водную фазу отбирают 100-мкл микропипеткой, стараясь не захватить слой, находящийся между фазами.
Плазмидную ДНК осаждают двумя объемами 95%-ного охлажденного во льду этанола и дальше действуют, как на 9-м этапе. Полученный осадок растворяют в буфере для соответствующей рестриктазы.
15.3. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
Электрофорез в геле
Для выявления и предварительной характеристики ДНК плазмид, присутствующих в клиническом материа-ле или лабораторных штаммах грамотрицательных и грамположительных бактерий, подходят обычные мето-ды электрофореза в геле с незначительными модифика-циями [10, 23]. Метод выделения плазмид с ДСН (разд. 15.1.3) широко применяется в сочетании с анализом ДНК гель-электрофорезом [26]. При этом, однако, в частично очищенных клеточных лизатах могут быть выявлены лишь те плазмиды, молекулярная масса кото-рых лежит в пределах от 0,6-106 до 100-106. Мы же ис-пользуем метод, описанный в разд. 15.2, который по-зволяет выявлять плазмиды с мол. массой от 0,6 — 10б до 350-106.
При электрофорезе плазмидной ДНК в геле расстояния, которые проходят разные виды молекул, находятся в обратной зависимости от значений их молекулярной массы. Во всех публикуемых в настоящее время методиках используются либо вертикальные, либо горизонтальные пластинки с гелем, регулируемые источники питания и источники коротковолнового ультрафиолетового света. Электрофорезу подвергают даже частично очищенные лизаты (как правило, достаточно 10— 20 мкл).
Для электрофореза используют стандартный прибор, в котором вертикально расположенная пластина с ге-

Рис. 15.1. Электрофорез в агарозном геле неочищенных лизатов, полученных из разных штаммов бактерий [8]. Образец 1 (слева): стандартные плазмидные ДНК с варьированием по мол. массе от 62-106 (самая верхняя полоса) до 1,8-106 (самая нижняя полоса). Образцы 2—7: плазмиды, содержащиеся в разных бактериальных штаммах. Хромосомная ДНК расположена в полосе, помеченной буквами Хр.
Лем (размеры геля 100X140X2,5 мм) имеет 12 лунок для нанесения проб (6,5x15x2,5 мм). Такой прибор можно купить (Aquebogue Machine and Repair Shop, P. 0. Box 205, Aquebogue, N Y1131) или изготовить в мастерских. Концентрация агарозы (тип Seakem ME, Marine Colloids, Inc., Rockland, Maine) в геле варьирует от 0,25 до 1,5% в стандартном буфере для электрофореза: 89 мМ трис, 2,5 мМ двунатриевая соль ЭДТА и 8,9 мМ борная кислота. Электрофорез проводят обычно в течение 2 ч при комнатной температуре, напряжении 120 В и силе тока 60 мА. Затем гель помещают в раствор бромистого этидия (0,4—1,0 мкг/мл) на 15 мин, после чего ДНК выявляют в дальнем ультрафиолете.
На рис. 15.1 показана фотография одного такого геля (0,7%-ная агароза). Полоса Хр соответствует хромосомной ДНК, находящейся в частично очищенном препарате. В первом образце кроме этой полосы имеется несколько полос, соответствующих плазмидной ДНК с разными, но известными молекулярными массами из различных штаммов бактерий; эти ДНК используются в качестве стандартов. При построении графической зависимости в логарифмических координатах перемещения в геле плазмидной ДНК от молекулярной массы этой ДНК получают прямую линию в пределах от 100- • 106 до 1-Ю6. Интерполяцией можно получить значения молекулярной массы плазмид из различных бактерий.
Для определения молекулярной массы неизвестных плазмид с помощью электрофореза в агарозном геле в качестве стандартов используют плазмиды, молекуляр-ная масса которых известна (табл. 15.1). Чтобы выявить плазмиды с большой молекулярной массой, клетки ли- зируют по методу, описанному в разд. 15.2. Для удоб-
Таблица 15.1. Плазмиды, используемые в качестве стандартов молекулярной массы, и бактерии, служащие их источником Бактерия? Молекулярная масса плазмидной ДНК (-10”) Pseudomonas aeruginosa PA02 (pMGl) 312 P. aeruginosa PA02 (pMG5) 280 Escherichia coli DT78 (TP116) 143 E. coli DT41 (R27) 112 Salmonella typhimurium LT2 60 P. aeruginosa PA02 (RP1) 38 E. coli K-12 J5-3 (Sa) 26 E. coli K-12 W1485-1 (RSF2124) 7,4 E. coli K-12 W1485-1 (RSF1010) 5,5 E. coli JC411 (ColEl) 4,2 E. coli W1485-1 (PMB8) 1.8 ° Эти штаммы можно получить у Э. Ледерберг, Plasmid Reference Center, Department of Medical Microbiology, Stanford University Medical School, Stanford, CA 94305 (telephone 415/321—2300).
ства рекомендуется разделять раствор плазмидной ДНК, полученный для каждого из штаммов, на порции объемом по 20 мкл и хранить их при —20 °С.
Гель-электрофорез
Рестриктаза катализирует расщепление двухцепочечной ДНК в специфических сайтах узнавания [1, 29], причем места расщепления в разных цепях смещены от-носительно друг друга. В случае фермента Eco R1, на-пример, специфическая нуклеотидная последователь-ность, которую он узнает, выглядит так:
1
GAATTC
CTTAAG,
t
где стрелки указывают места расщепления. Плазмидная ДНК (как и любая другая в этом отношении) после обработки эндонуклеазой дает характерный набор фрагментов, зависящий от числа и расположения в геноме специфических сайтов узнавания. Эти фрагменты разделяют электрофорезом в агарозном геле. Сравнение картин разделения фрагментов, полученных из разных плазмид, позволяет качественно оценивать степень их родства. Фрагменты ДНК можно также перенести из ага-розного геля на полоску нитроцеллюлозы (перенос материала из геля на бумагу называется блоттингом), а если провести их гибридизацию с радиоактивно меченным образцом ДНК, можно выявить фрагменты, содержащие последовательности, гомологичные последовательностям образца; гомологичные фрагменты выявляются при радиоавтографии в виде резких полос на ниг- роцеллюлозной полоске [28].
К настоящему времени описано около 150 различных рестриктаз; некоторые из них производятся в промышленных масштабах (Bethesda Research Laboratory, Rockville, MD 20850; Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN 46514; New England Biolabs, Beverly, Ma 01915). Для оптимального функционирования каждой рестриктазы нужны особые условия, которые обычно указываются

Рис. 15.2. Наборы полос, получаемые при обработке плазмид Арг из разных энтеробактерий рестриктазой Ніпс [8]. Обработку и электрофорез проводили, как описано в разд. 15.3 2. Гель окрашивали бромистым этидием. Картина люминесценции, возникающая в результате иитеркаляции красителя при освещении ультрафиолетом, сфото-графирована на пленку «Поляроид».
изготовителем. Полезность анализа с применением рест- риктаз мы проиллюстрируем на следующем примере.
Кроза и др. [8] исследовали ряд устойчивых к ампициллину штаммов, относящихся к 1-му типу Shigella dysetiteriae,которые были выделены во время разных эпидемий. Во всех случаях детерминанта устойчивости к ампициллину принадлежала плазмиде с мол. массой
106. На рис. 15.2 показаны картины разделения фрагментов плазмидной ДНК, полученных после обработки рестриктазой Ніпс II. Во всех пробах была обнаружена сходная плазмидная ДНК с мол. массой 5,5-106. Такой результат свидетельствует о том, что изучаемые плазмиды гомологичны.
Для расщепления плазмидной ДНК рестриктазой HincII использовали следующую методику.
Обрабатывали 20 мкл очищенной плазмидной ДНК (~0,2 мкг ДНК) в буфере (10 мМ трис-НС1, 50 мМ NaCl, 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 6 мМ MgCl2, pH 7,0) рестриктазой HincII (New England Biolabs; 2000 ед. акт./мл), которую добавляли в количестве 2 ед. акт.
Реакционную смесь инкубировали 90 мин при 37 °С.
Реакцию останавливали добавлением 5 мкл водного раствора 0,07%-ного бромфенолового синего, 7%-ного ДСН и 33%-ного глицерина.
Проводили электрофорез всей реакционной смеси в 0,7%-ном агарозном геле, как описано в разд. 15.3.1.
Сравнивали картины полос фрагментов после окрашивания бромистым этидием (разд. 15.3.1).
В некоторых случаях крайне желательно экстрагиро-вать разделенные в агарозном геле фрагменты. Они могут понадобиться для исследования химическими и физическими методами, а также для установления деталей структуры рестрикционным анализом, определения последовательности оснований в ДНК, гетеродуплексно- го анализа и гибридизации с использованием эндонуклеазы [6] или блоттинга методом Саузерна [28]. Приводимая ниже методика [11] позволяет экстрагировать с хорошим выходом всевозможные интактные, биологически активные молекулы ДНК непосредственно из полос, которые они образуют в агарозном геле. Для осуществления этой операции нужен выпускаемый промыш-ленностью препарат агаразы (Calbiochem, La Jolla, Calif., номер по каталогу 121811)—фермента, расщепляющего агарозу.
Гидролиз эндонуклеазой и электрофорез в агарозе с окраской бромистым этидием (разд. 15.3.1) описаны выше. Фрагменты ДНК, разделенные в 0,6%-ном агарозном геле (трубочка диаметром 0,6 см и длиной 11 см), выявляют в ультрафиолете, а диски геля с этими фрагментами вырезают бритвенным лезвием. Можно одновременно обрабатывать несколько вырезанных дисков (по 0,05—0,1 г каждый) с одним и тем же фрагментом.
Разрушают диск геля в 0,1 М трисе, pH 5,95 (0,1 мл на диск). Суспензию гомогенизируют, набирая и выпуская ее трижды пластмассовым шприцем (без иглы) объемом 1 мл в центрифужный стакан из пирекса.
Добавляют раствор агаразы (50 мкг на диск) в 0,1 М трис-НС1, pH 5,95 (концентрация фермента 1 мг/мл), и инкубируют 2 ч при 37°С.
Удаляют агарозу центрифугированием при 48 000 g в течение 30 мин при 4 °С.
При необходимости надосадочную жидкость, содержащую ДНК, можно сконцентрировать осаждением двумя объемами этанола или диализом против полиэти- ленгликоля.
Перед концентрированием проводят дополнительную очистку препарата пропусканием надосадочной жидкости через фильтр Swinnex (Millipore Corp., Bedford, Mass.) с размером пор 0,45 мкм.
При получении ДНК этим методом выход составляет ~75—80% для плазмидной ДНК с мол. массой 7,4- •106—60 -106 и для фрагментов, полученных под действием рестриктазы Eco RI с размерами от 0,75-106 до 13,9-106. ДНК, экстрагируемая с помощью агаразы, вызывает трансформацию фактически с той же частотой (для клеток Е. coli),что и ДНК, не контактировавшая с этим ферментом. Извлеченные из гелей фрагменты ДНК с успехом использовались в экспериментах по
клонированию в качестве источника или носителя генетической информации [11].
Центрифугирование в градиенте плотности
(с использованием бромистого этидия)
Молекулы плазмидной ДНК, полученные из клеток бактерий, представляют собой двухцепочечные ковалентно замкнутые кольцевые структуры, не имеющие свободного конца, вокруг которого они могли бы рас-кручиваться. Бромистый этидий, относящийся к ряду фенатридиновых красителей, связывается с ДНК и РНК и тормозит функционирование нуклеиновых кислот [5, 15]. Клетки лизируют и лизаты наносят на градиенты хлористого цезия, содержащие бромистый этидий. При высокоскоростном центрифугировании ДНК седиментц-
Рис. 15.3. Результат центрифугирования бактериального лизата, полученного при добавлении тритона Х-100, в цезий-этидиевом градиенте. При освещении ближним ультрафиолетовым светом видны две полосы люминесценции интеркалировавшего в ДНК бромистого этидия. Верхняя полоса соответствует хромосомной ДНК, нижняя — плазмидной ДНК.
Таблица 15.2. Компоненты смеси, добавляемые при центрифугировании в цезий-этидиевом градиенте плотности Состав пробы Тип ротора 50 ТІ-60 Лизат 3,2 мл 24 мл ТЭН-буфер 2,0 мл 3 мл CsCl 4,9 г 23 г Бромистый этидий 0,2 мл 1 мл 1.
рует до установления равновесия. Встраиваясь в молекулу ДНК, бромистый этидий уменьшает ее плотность [3, 25]. Линейная молекула ДНК или разомкнутая кольцевая (с разрывом в одной цепи) молекула плазмидной ДНК не имеет тех физических ограничений, которые характерны для ковалентно замкнутой кольцевой (КЗК) плазмидной ДНК. Вследствие этого первые ДНК связывают значительно больше молекул бромистого этидия и их плотность становится меньше, чем плотность КЗК-ДНК. Эта разница в связывании красителя позволяет разделять разные формы плазмидной ДНК. В градиентах хлористого цезия формы с встроенным бромистым этидием благодаря люминесценции последнего могут быть визуально зафиксированы в ультрафиолетовом свете в виде дискретных полос (рис. 15.3).
Для осуществления методики, приведенной ниже, требуются препаративная ультрацентрифуга, переносной источник ультрафиолетового света (Black Ray, UVL-22; Ultraviolet Products, Inc., San Gabriel, Calif.), градиентатор и рефрактометр (Abble 3L, Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY). Материал, выделенный с помощью тритона Х-100 (разд. 15.1.2), можно, к примеру, обработать следующим образом.
В полиалломерный центрифужный стакан размером 1,6X7,6 см центрифуги Beckman вносят 5 г хлористого цезия, 2 мл буфера ТЭН и 3,2 мл клеточного лизата.
Перемешивают содержимое стакана до полного растворения хлористого цезия и добавляют 0,2 мл рас-твора бромистого этидия (10 мг/’мл в ТЭН-буфере).
Измеряя показатель преломления раствора, доводят его плотность до 1,3925±0,001 г/см3 добавлением ТЭН-буфера или сухого хлористого цезия. Показатель преломления измеряется с ошибкой и может быть раз-ным при измерении разными приборами, поэтому реко-мендуется в пробных экспериментах стандартизировать измерения. При необходимости в стаканы доливают ми-неральное масло.
Подготавливают стаканы к ультрацентрифугированию, согласно предписанию фирмы-изготовителя, и ставят их в соответствующий ротор. Стаканы должны быть хорошо уравновешены.
В соответствии с объемом лизата можно использовать полиалломерные стаканы любого размера. Например, при крупномасштабном выделении с использованием тритона получают 20 мл лизата, которые можно центрифугировать в полиалломерном стакане для рото-ра Beckman Ti-60. А если объем лизата около 10 мл, то можно провести центрифугирование в полиалломерном стакане для 65-го ротора (Beckman). В табл. 15.2 ука-заны различные соотношения буфера ТЭН, хлористого цезия и бромистого этидия.
Центрифугирование проводят со скоростью 40 000 об/мин при 15 °С в течение по крайней мере 44 ч

Номер срракции
Рис. 15.4. Определение числа копий плазмид. Бактериальный штамм, содержащий плазмиды, был выращен иа минимальной солевой среде с добавкой казаминовых кислот и глюкозы. После введения метки и лизиса полученный лизат был отцентрифугирован в цезий-этидиевом градиенте, как описано в разд. 15.3.3. Фракции (по семь капель каждая) собирали в емкости для микротитрования и измеряли в иих ра-диоактивность.
в препаративной ультрацентрифуге Beckman (или какой-либо аналогичной ей). После центрифугирования просматривают стаканы с градиентами в ультрафиолете в поисках полос, люминесцирующих благодаря образованию комплексов ДНК с бромистым этидием. Отбирают плазмидную ДНК (нижняя полоса в градиенте на рис. 15.3) через дно стакана, пользуясь каким-либо прибором для фракционирования градиентов.
Когда в опыт берут радиоактивный препарат ДНК, фракции проверяют на радиоактивность. Типичный профиль распределения радиоактивности, показанный на рис. 15.4, свидетельствует о четком разграничении фракций плазмидной ДНК с большей плотностью и хромосомной ДНК с меньшей плотностью.
Освобождают ДНК от бромистого этидия, экстрагируя препарат не менее четырех раз изопропанолом, насыщенным хлористым цезием.
Диализуют препарат ДНК против соответствую-щего буфера, чтобы удалить хлористый цезий.
Разделяют очищенную плазмидную ДНК на несколько порций и хранят при —20 °С.
Метод лизирования клеток с последующим центрифугированием в градиенте плотности можно использовать для выяснения вопроса о том, содержит ли данный бактериальный штамм плазмидную ДНК. Правда, данный метод требует дорогостоящего оборудования и больших затрат времени, к тому же с его помощью можно проверить одновременно лишь относительно небольшое число культур. Однако это лучший метод очистки плазмидных ДНК в количествах, достаточных для дальнейшего анализа.
Некоторые рекомендации по поводу центрифугирования в градиенте плотности.
Чтобы полностью устранить загрязнение хромосомной ДНК (верхняя полоса в градиенте, рис. 15.3), проводят вторичное центрифугирование собранной плазмидной ДНК в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием. Собирают плазмидную ДНК, вновь об-разовавшую полосу, с помощью раскапывания градиен-та со дна стакана или шприцем, проколов иглой стенку стакана.
Бромистый этидий добавляют после CsCl, так как релаксирующие белки, которые присутствуют в некоторых плазмидах и образуют одноцепочечные разрывы в ДНК, могут активироваться бромистым этидием [20]. CsCl в высокой концентрации (7 М) инактивирует релаксационные белки [20] в плазмидах, благодаря чему можно получить больший выход ДНК.
Одноцепочечные разрывы плазмидной ДНК даже при высоких концентрациях соли может вызывать видимый свет (в присутствии бромистого этидия), поэтому все операции должны проводиться в отсутствие прямого освещения.
Формирования четких полос и хорошего разделения плазмидной и хромосомной ДНК можно достичь центрифугированием в течение ночи в роторе Beckman № 65 со скоростью 45 000 об/мин при 15 °С. Разработанные недавно новые модели роторов позволяют разделять плазмидную и хромосомную ДНК еще быстрее.
Определение числа плазмидных копий
Число копий какой-либо плазмиды, приходящееся на бдну хромосому, представляет собой характеризующий плазмиду параметр, который дает информацию о способе ее репликации.
Число плазмидных копий можно установить центри-фугированием меченного 3Н-тимином клеточного лизата в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием. Для подсчета числа копий используют приводимое ниже отношение между плазмидным и хромосомным пи-ками:
тт „ Радиоактивность (имп/мин) плазмидного пика MWX
Число КОИИИ=+= т7 { Т7ТТГ,
Радиоактивность (имп/мин) хромосомного пика MWn
где MWXи MWn— молекулярные массы хромосомы и плазмиды соответственно.
Для тиминзависимого штамма в ростовую среду к соответствующему количеству тимина добавляют 3Н-тимин (7 мкКи/мл). Для тиминнезависимого штамма в ростовую среду добавляют 1 мкг/мл тимина, 250 мкг/мл дезоксиаденозина и 7 мкКи/мл 3Н-тимина.
Методика включает следующие операции.
Выращивают культуру (1 мл) штамма, содержащего плазмиду, при 37 °С в присутствии 7 мкКи/мл 3Н-тимина до плотности, равной 2-Ю8 клетка/мл.
Клетки осаждают центрифугированием, промывают их в ТЭ-буфере (0,01 М трис-НС1, 0,001 М ЭДТА, pH 8,1) и ресуспендируют в 400 мкл 0,5 М сахарозы (высокоочищенная, не содержащая рибонуклеазы сахароза в 50 мМ трисе, pH 8,0).
К суспензии клеток добавляют 0,2 мл 0,2 М ЭДТА, pH 7,8, и хорошо перемешивают.
Добавляют 0,2 мл 1%-ного лизоцима (в 0,25 М трисе, pH 8,0) и хорошо перемешивают. Немного встряхивают и ставят в лед на 15 мин.
Добавляют к суспензии 1,2 мл 1,2%-ного сарко- зила, после чего немедленно вносят 0,1 мл проназы (1 мг/мл) в 0,01 М трисе, 0,02 М ЭДТА, pH 8,1. Прона- зу следует предварительно проинкубировать 2 ч при 37 °С для самопереваривания, а затем прогреть перед использованием 2 мин при 80 °С. Смесь осторожно перемешивают и инкубируют при 37 °С до тех пор, пока суспензия полностью не просветлится.
Быстро набирают и выдувают обратно раствор ДНК 5-мл пипеткой (для получения фрагментированной хромосомной ДНК), пока раствор не перестанет быть вязким.
Центрифугируют 5 мл образца ДНК с радиоактивностью около 500 000 имп/мин в цезий-этидиевом градиенте. В данном случае показатель преломления должен быть на 0,0025 меньше, чем в случае градиента для тритонового лизата. Центрифугируют также образец ДНК в линейном градиенте сахарозы (от 5 до 20%).
Раскапывают градиенты по дискам фильтровальной бумаги Whatman ЗММ.
Осаждают радиоактивную ДНК холодной 5%-ной ТХУ, содержащей 50 мкг/мл тимина, промывают фильтры 95%-ным этанолом и высушивают. Радиоактивность измеряют в сцинтилляционном счетчике.
На рис. 15.4 изображен профиль радиоактивности разделенной в цезий-этидиевом градиенте общей клеточной ДНК из штамма Е. coli,содержащего плазмиду.
Рекомендация по определению числа плазмидных копий
В одном и том же градиенте можно выявить как ковалентно замкнутые кольцевые молекулы ДНК (КЗК-ДНК), так и отличные от них плазмидные открытые кольцевые молекулы ДНК (ОК-ДНК). Они разделяются в цезий-этидиевом и сахарозном градиентах. Например, димеры двух КЗК-молекул ДНК мигрируют вместе с мономерами КЗК-ДНК в цезий-этидиевом градиенте, а в сахарозном градиенте осаждаются порознь. Димеры, состоящие из одной КЗК- и одной ОК- молекулы, в цезий-этидиевом градиенте дают полосу в промежуточном положении между мономерами КЗК- и OK-молекулами. Димеры двух OK-молекул ДНК мигрируют в цезий-этидиевом градиенте вместе с мономерами ОК-ДНК, но дают отдельную от них полосу в градиенте сахарозы.
Градиенты сахарозы можно готовить при помощи градиентной смесительной камеры. Другой способ за-ключается в приготовлении раствора сахарозы с кон-центрацией, средней между крайними концентрациями желаемого градиента с последующим замораживанием его при —20 °С. Если такой раствор медленно оттаивает в течение ночи при 4 °С, то при этом получается подхо-дящий для аналитических целей градиент. Например, замороженный раствор 12,5%-ной сахарозы после от-таивания даст градиент приблизительно от 5 до 20%.
Выявление гомологии
(с использованием эндонуклеазы, специфически расщепляющей одноцепочечную ДНК)
Основой для любого изучения гомологии является диссоциация двухцепочечной плазмидной ДНК и последующий специфический отжиг одноцепочечной ДНК из гомологичного или гетерологичного источника (реассо-циация ДНК). Плазмидные гомо- и гетеродуплексы ана-лизируют с помощью специфичной по отношению к од-ноцепочечной ДНК эндонуклеазы S1 из Aspergillus огу- гае. Приводимая ниже методика [6] позволяет точно и быстро определять, насколько гомологичны или гетеро- логичны полинуклеотидные последовательности. Это особенно полезно для проведения экспресс-анализов и для других исследований, в которых требуется постановка большого числа проб на гибридизацию ДНК — ДНК.
В качестве стандарта используют очищенную радиоактивно меченную ДНК, которую гибридизуют с очищенной суммарной клеточной ДНК из штаммов, содержащих плазмиды. ДНК какого-либо штамма, не содержащего плазмиды, служит контролем. Для проведения реакций реассоциации ДНК — ДНК, оцениваемых методом с применением эндонуклеазы S1, фрагментированную денатурированную очищенную плазмидную ДНК с радиоактивностью 5000—10 000 имп/мин (обычно это меньше 0,001 мкг ДНК) инкубируют со 150 мкг нефрак- ционированной суммарной фрагментированной денатурированной бактериальной ДНК из штаммов, содержащих и не содержащих плазмиды, в 0,42 М NaCl в общем объеме 1 мл. Такие смеси инкубируют при температуре, которая зависит от суммарного процентного содержания гуанина и цитозина (G + C) в плазмидной ДНК. В случае гомологии реассоциация осуществляется фактически полностью. Время, необходимое для полной реассоциа-ции плазмидной ДНК, представляет собой функцию ее молекулярной массы и концентрации ионов. Время ре-ассоциации определяют, вычисляя значение C0/i/a, где С0 — начальная концентрация ДНК, П/2— время дости-жения 50%-ной реассоциации ДНК (при концентрации С0) для данной температуры, концентрации соли и раз-мера фрагментов ДНК. Эмпирическая формула [7] имеет вид
п? Молекулярная масса плазмидной ДНК
L of і/і— 3-ю7 ‘
Время инкубации, требуемое для получения полной реассоциации в присутствии 0,42 М NaCl, равно приблизительно 8 Co/i/a. Таким образом,
864/1/2 ~ 6Vx>
где С0 — начальная концентрация плазмидной ДНК (которую можно вычислить или оценить, исходя из числа копий плазмиды), а Н— время реассоциации.
В оптимальных условиях при инкубации только одной меченой плазмидной ДНК реассоциация цепей этой ДНК друг с другом (самореассоциация) должна составлять менее 10%, в то время как в присутствии гомологичной ей немеченой ДНК реассоциировать должно более 85%- В каждом эксперименте измеряют также реассоциацию меченой плазмидной ДНК с ДНК не несущих плазмид бактериальных клеток и вычитают величину этой реассоциации (около 10% или меньше) из величии реассоциации, определенных для каждой реакции.
Гибридизация
Смесь для реассоциации: 150 мкг немеченой, обработанной ультразвуком суммарной клеточной ДНК; меченая обработанная ультразвуком плазмидная ДНК с радиоактивностью 5000—10 000 имп/мин; NaCl в количестве, достаточном для создания концентрации 0,42 М в общем объеме 1,0 мл.
ДНК денатурируют кипячением в этой смеси в течение 10 мин и затем раствор ДНК помещают в лед.
Инкубируют смесь для реассоциации при температуре 55—70 °С, зависящей от процентного содержания G + C в плазмидной ДНК.
Плазмидную ДНК, меченную 3Н-тимином, выделяют в виде КЗК-ДНК методом, в котором для лизиса клеток используется тритон (разд. 15.1.2). Можно также ДНК пометить in vitro. Удельная активность меченной 3Н-ти- мином ДНК, получаемой этим методом, обычно составляет ~ 106 имп/мин/мкг. Эту плазмидную ДНК подвергают обработке ультразвуком, чтобы получить фрагменты с мол. массой ~2,5-105.
Суммарную клеточную ДНК готовят, как описано в гл. 15. Эту ДНК также фрагментируют с помощью ультразвука до величин мол. массы ~2,5-105.
Реакция с эндонуклеазой S1
Эндонуклеаза S1 с очень хорошей активностью имеется в продаже (Sigma, номер по каталогу 5255).
Готовят исходную реакционную смесь (назовем ее Sl-реакционной смесью): 0,125 мМ ZnSOn 87,5 мМ
NaCl, 37,5 мМ Na-ацетатный буфер, pH 4,5, 25 мкг/мл ДНК (из тимуса теленка) — и хранят ее замороженной при —20 °С в аликвотах по 0,8 мл. В реакционную смесь при проведении эксперимента входит 0,8 мл Sl-реакционной смеси и 0,2 мл смеси для реассоциации. Конечные концентрации веществ в пробе составляют: 0,1 мМ ZnS04, 150 мМ NaCl (с учетом NaCl, внесенного с 0,2 мл смеси для реассоциации), 30 мМ Na-ацетатный буфер, pH 4,5, и 20 мкг/мл ДНК из тимуса теленка. Для каждой реакции реассоциации ставят две пробы с обработкой эндонуклеазой S1 и две пробы без обработки ферментом.
Добавляют 187,5 ед. акт. эндонуклеазы S1, чтобы запустить реакцию, и инкубируют 20 мин при 50 °С.
Останавливают реакцию, помещая пробирки со смесями в ледяную баню; в качестве соосадителя добавляют 50 мкг ДНК из тимуса теленка (в данном случае подходит любая имеющаяся в продаже не очень чистая ДНК) и 0,3 мл холодной 20%-ной ТХУ. Выпавший осадок собирают фильтрованием под вакуумом на мембранный фильтр (тип НА, Millipore Corp.). Фильтры вы- Таблица 15.3. Определение гомологии между гетерологичными плазмидами при помощи эндонуклеазы,
образующей разрывы в одной цепи ДНК Ка Образец Радиоактивность после обработки иуклеазой S1 имп/мнн а Процент в опыте Усредненный про с ферментом без фермента цент 1. 3Н-ДНК плазмиды, денатурированная нагреванием 20
18 821
832 2,4
2,2 2,3 2. Денатурированная нагреванием и реассоциированная плазмидная 3Н-ДНК 50
53 850
890 6,0
6,0 6,0 3. Реассоциировавшая смесь денатурированных нагреванием плазмидной 3Н-ДНК н суммарной клеточной ДНК, содержащей эту плазмидную ДНК 790
798 850
825 92,9
96,7 94,8 4. Реассоциировавшая смесь денатурированных нагреванием плазмидной 3Н-ДНК и суммарной клеточной ДНК, содержащей гетерологичную нлазмиду 45
63 820
881 5,5
7,1 6,3 5. Реассоциировавшая смесь денатурированных нагреванием плазмидной 3Н-ДНК и суммарной клеточной ДНК из штамма, не содержащего плазмиды 60
62 860
880 7.0
7.0 7,0 Процент
ГОМОЛОГИИ,
приведенный и с поправкой^
100
Значения радиоактивности были получены после вычи- Цифры в этой колонке получены путем вычитания циф-
тания фона 20 имп/мнн. ры в строке 2 из соответствующих цифр в строках 3, 4 и 5
и последующим делением на цифру в строке 3.
сушивают при 70 °С и определяют радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. Контроли должны включать пробу с меченной in vivo плазмидной ДНК, по которой можно выявлять любое количество присутствующей в препарате нуклеазы, производящей двухцепочечные раз-рывы; пробу, содержащую только денатурированную и реассоциированную меченую ДНК, которая служит контролем самореассоциации меченой ДНК в условиях опыта; пробу с денатурированной меченой ДНК, по которой судят об активности препарата эндонуклеазы S1. В табл. 15.3 показано, как обработать исходные дан-ные по радиоактивности, чтобы получить процент гомо-логии ДНК. Результаты выражены в виде процентов необработанных контролей по отношению к величинам, полученным для гомологичной реакции.
Определение гомологии цепей ДНК с помощью электронной микроскопии
Если двум частично комплементарным цепям плазмидной ДНК дать возможность ренатурировать, то образуются гетеродуплексные молекулы, которые можно исследовать с помощью электронного микроскопа. Поскольку при электронно-микроскопическом анализе в случае соответствующего приготовления образцов одно- и двухцепочечные участки нуклеиновых кислот различа-ются, существует возможность картирования гомологич-ных и негомологичных участков. С тех пор как в прак-тику вошли способы проверки с применением рестрик- таз и методы выявления гомологий ДНК в растворе по радиоактивности, методология гетеродуплексного анали-за с помощью электронного микроскопа перестала ши-роко применяться для анализа плазмидной ДНК- Хотя техника такого анализа требует большого эксперимен-тального искусства и специального оборудования, она все же заслуживает рекомендации как способ точной локализации различий между плазмидами и наилучшей оценки организации плазмидной ДНК-
По стандартной методике Кляйншмидта [18] к ДНК прикрепляют основной белок, и она переходит в образо-ванный денатурированными белками монослой, созда-ваемый на разделе фаз вода — воздух. Одноцепочечная
ДНК сворачивается и на электронной микрофотографии имеет вид «куста». Однако в присутствии формамида одноцепочечные участки более или менее расправляются, и в этих условиях их можно увидеть и отличить от двухцепочечных. Таким образом, добавление формамида позволяет измерять одноцепочечные и двухцепочечные участки ДНК и служит основой для анализа форми-рования гетеродуплексов из цепей плазмидных ДНК. Методику Кляйншмидта с успехом применяют для опре-деления молекулярных масс плазмидной ДНК путем измерения длины контура хорошо расправленных рас-крытых, кольцевых или линейных, двухцепочечных мо-лекул плазмидной ДНК.
Если эксперименты по получению гетеродуплексов начинают с КЗК-ДНК, желательно ввести одноцепочечный разрыв таким образом, чтобы при денатурации образовались две интактные молекулы — одноцепочечная линейная и одноцепочечная кольцевая. Этого достигают следующим образом: сначала отделяют КЗК-молекулы от всех других и затем производят слабую обработку дезоксирибонуклеазой или облучают видимым светом в присутствии бромистого этидия [3]. При такой слабой обработке образуются лишь одноцепочечные разрывы. КЗК-ДНК плазмид можно также расщеплять рестрик- тазами в условиях, когда расщепление происходит толь-ко по одному месту. Денатурацию обычно проводят про-греванием или обработкой щелочью. Способ, применяе-мый для денатурации ДНК, должен быть достаточно эффективным для того, чтобы привести к полному рас-хождению цепей, однако воздействие не должно быть настолько сильным, чтобы вызвать деградацию ДНК и внести дополнительные разрывы. Для ренатурации в водном растворе требуется высокая концентрация соли и нагревание до температуры примерно на 30 °С ниже температуры плавления (Тт)- Однако и соль в высокой концентрации, и высокая температура могут привести к одноцепочечным разрывам. Поэтому ренатурацию лучше осуществлять с формамидом — растворителем, эф-фективно снижающим Тт. При этом пригодны достаточ-но разведенные растворы ДНК, а реакцию можно про-водить при температуре, равной или ниже комнатной, в течение более длительного времени. Оптимальна рена-
Рис. 15.5. Образование гетеродуплекса между R-плаз- мидой R6K и ее делецион- ным мутантом RSF1040 [7]. Гетеро дуплексные молекулы ДНК получали из ДНК двух плазмид, подвергавшихся одноцепочечному разрыву под действием рентгеновских лучей по методике, описанной в разд. 15.3.5. Петля слева представляет собой одноцепочечную (ss) ДНК плазмиды R6K, которая отсутствует из-за делеции в плазмиде RSF 1040. Большая петля справа — двухцепочечная ДНК (ds),по которой можно рассчитать область гомологии обеих плазмид. В данном случае двухцепочечная область составляет около 70% ДНК плазмиды R6K.

турация приблизительно 50% взятой ДНК, так как про-дукты ренатурации смеси родственных молекул ДНК со-стоят из неренатурировавших одноцепочечных фрагмен-тов, гомодуплексов или гетеродуплексов. Поэтому кине-тика ренатурации такова, что по достижении 50—75%- ного уровня реассоциации происходит предпочтительное образование гомодуплексов, а не желаемых гетеродуп-лексов. На рис. 15.5 изображен типичный гетеродуплекс молекул плазмидной ДНК, имеющих одноцепочечный разрыв, и ее делеционной мутантной формы. Двухце-почечные и одноцепочечные области достаточно хорошо различаются.
В основе любого электронно-микроскопического анализа ДНК лежит приготовление мономолекулярного слоя нуклеиновой кислоты. Для этого на поверхности водного раствора создается пленка белка (цитохрома с). Денатурированный на поверхности белок образует нерастворимую пленку, которую можно рассматривать как мономолекулярний слой. ДНК адсорбируется на белковой пленке и вследствие этого переходит из трехмерной конфигурации в растворе в двумерную на пленке. Затем монослой с ДНК переносят в виде пленки на твердую подложку, покрывающую сетку для образцов, приготавливаемых для электронной микроскопии. Подложки обычно изготавливают из парлодия или производных нитроцеллюлозы.
Для улучшения контраста образец натеняют солями урана; применяется также натенение металлами, для того чтобы увеличить различие в контрастности между двухцепочечными и одноцепочечными участками ДНК- (Подробное описание методов электронной микроскопии см. в гл. 4.) Следует избегать чрезмерного натенения, поскольку при этом из-за неровностей подложки и слишком толстого слоя металла, напыленного на участках, представляющих собой фон, разница в контрасте между фоном и объектом и между одноцепочечными и двухцепочечными ДНК уменьшится. В литературе описаны разные методики [18] приготовления белкового монослоя (например, методика растягивания, диффузионная методика, методика «высвобождения в один этап»), В случае методики растягивания кювету наполняют соответствующей гипофазой и на ее поверхность под углом (например, с предметного стекла) наносят раствор с белком и нуклеиновой кислотой.
Для определения гомологии плазмидных ДНК при помощи электронной микроскопии рекомендуется следующий метод.
0,1 мкг каждой из двух ДНК, взятых для образования гетеродуплексов, помещают в маленькую пробирку типа Eppendorf (West Coast Scientific Co., P. O. Box 2947, Rockridge Station, Oakland, CA 94618; номер no каталогу 3810). ДНК денатурируют добавлением 0,25 мл 0,1 М NaOH, 0,02 М Иа2-ЭДТА и достаточного количества 10 М NaOH (1—5 мкл) до установления pH в пределах 12,4—12,6. Выдерживают ДНК в этом растворе при комнатной температуре в течение 10 мин.
Раствор нейтрализуют добавлением 25 мкл 1,8 М трис-НС1, 0,2 М трис-основания и 0,25 мл формамида (Mallinckrodt, 99%). Значение pH должно находиться между 8,4 и 8,6. Если это не так, то добавляют еще 2 мкл трис-буфера (при pH>8,6) или 2 мкл NaOH (при рН Позволяют денатурированной плазмидной ДНК ренатурировать в течение 1,5 ч. Для прекращения рена- турации раствор охлаждают до 0—4 °С и диализуют против 0,01 М трис-HCl и 0,001 М ЭДТА, pH 7—8,5, при 4 °С 2 ч. Раствор, в котором прошла ренатурация, можно хранить при 4 °С и отбирать из него пробы в любой момент в течение 1 мес, хотя ДНК в этом растворе продолжает ренатурировать даже при 4 °С.
На этой стадии следует иметь подготовленную к работе кювету и все необходимое для спуска раствора на поверхность. Маленькая пластмассовая чашка Петри (например, чашка диаметром 50 мм для культуры тканей) хороша в качестве кюветы, а для наклонного спуска раствора на водную поверхность можно использовать предметные стекла для микроскопа. Стекла должны быть отмыты сначала кислотой, а затем раствором детергента, после чего их следует тщательно ополоснуть дистиллированной водой. Кюветы ополаскивают гипо-фазой, которая состоит из смеси 45 мл 0,01 М трис-НСІ, 1,1 мМ ЭДТА, pH 8,5, и 5 мл 99%-ного формамида (Mallincrodt). Кювету наполняют гипофазой до образо-вания выпуклого мениска.
Пользуясь чистым пинцетом, предметные стекла тщательно прополаскивают в растворе гипофазы и укрепляют их под углом 30—45° у внутреннего края чашки.
Распыляют небольшое количество порошка талька тонкого помола на половину пути между местом нане-сения раствора ДНК и нижним краем стекла. Тальк на-носят с помощью пастеровской пипетки, один конец ко-торой прикрыт бумажной тканью, а другой соединен с грушей. Можно также нанести тальк кисточкой из верб-люжьей шерсти.
Порошок талька служит для определения границ монослоя во время растягивания пленки, к тому же он обеспечивает некоторое сжатие пленки, удерживая края монослоя.
Добавляют в 5-мл стакан разового использования 95 мкл раствора прошедшей отжиг ДНК и 5 мкл свежеприготовленного на дистиллированной воде раствора (2 мг/мл) цитохрома с(Sigma, тип 11).
Раствор ДНК. с цитохромом с набирают с помощью какого-либо механического наборного устройства в пипетку с надетым на нее 100-мкл пластмассовым наконечником (его кончик должен быть отрезан).
Раствор ДНК с цитохромом с медленно выливают на предметное стекло на высоте около 0,5 см над водной поверхностью. Между наконечником пипетки и гипофазой на стекле постоянно должен быть перешеек жидкости. Стараются не дышать над поверхностью и не двигать предметное стекло. Как только сформируется белковый монослой, тальк сразу же перемещается с предметного стекла к краям чашки.
Если образуются завихрения, часть талька по кругу возвращается обратно к стеклу, а пленка цитохрома за-нимает область, свободную от талька.
Через 1 мин после растягивания монослоя по поверхности берут пинцетом покрытую парлоидем сетку и осторожно опускают ее парлодием вниз на монослой белка; после некоторой паузы поворачивают и поднимают сетку под углом 20—30°. В норме сетка должна быть покрыта большой плоской каплей. Таким способом готовят две — три сетки с монослоем из разных участков поверхности.
Окрашивают образец, погружая сетку в 5-Ю”5 М уранилацетат на 30 с.
Опускают сетку в изопентан на 10 с, чтобы облегчить высушивание.
Одно- и двухцепочечные участки ДНК должны быть видны в электронном микроскопе без натенения, но натенение позволяет лучше их различать. Закрепляют сетки на предметном стекле при помощи липкой с обеих сторон ленты и затем напыляют их при вращении под углом около 7°, используя для этого 1,2-см отрезок платино-палладиевой (80 : 20) проволоки 23-го размера (Ted Pella, Inc.) в вольфрамовой корзине (Е. F. Fullam, Inc.). Разрежение в камере испарителя напыляющего аппарата перед напылением должно быть меньше 6-Ю-5 мм рт. ст.
Теперь сетки готовы к просмотру в электронном микроскопе. 20 разных гетеродунлексных молекул дают статистически надежные картины для измерения одно- и двухцепочечных участков. В качестве маркеров удобно использовать одноцепочечную ДНК фага ФХ и двухцепочечную ДНК. Увеличение при электронной микроскопии можно откалибровать по стандартной выпускаемой промышленностью решетке (Ted Pella, Inc.).
Длину ДНК на фотографических негативах измеряют при помощи увеличительного стенда (электронные планиметры фирм Numonic или Hewlett-Packard) или навесных проекционных систем (фотоувеличитель). Иногда пользуются ручным курвиметром, но это более трудоемко.
Рекомендации по определению гомологии ДНК с помощью электронной микроскопии
Необходимо соблюдать чистоту. Пристающие к поверхности вещества, такие, как детергенты, масляные пары и оставляемый пальцами жир, мешают формированию монослоя и равномерному распределению белка. Не следует допускать загрязнения этими веществами оборудования, посуды или растворов.
Трис, уранилацетат, Ка2-ЭДТА и парлодий нужно хранить в эксикаторе. Все реактивы должны быть химически чистыми. Перечисленные ниже растворы следует стерилизовать фильтрованием: 1 М трис, 0,1 М Na2- ЭДТА, 1,8 М трис-НСІ, 0,2 М трис, 0,1 М NaOH и 0,02 М Иаг-ЭДТА. Для приготовления исходного концентриро-ванного раствора уранилацетата делают 5-Ю-3 М рас-твор уранилацетата в 10 мл 0,05 и. НС1 и стерилизуют его фильтрованием. Для окрашивания концентрирован-ный раствор разводят в 100 раз 90%-ным этанолом. Концентрированный раствор хранят только 1 нед, а раз-веденный раствор для окрашивания — лишь в течение нескольких часов.
Формамид (HCONH2) гидролизуется с образованием формиата аммония, который в свою очередь дает аммиак и муравьиную кислоту. Происходящие при этом изменения ионной силы в растворах верхней и нижней фаз могут приводить к неполному расправлению одноцепочечной ДНК. Аммиак может испаряться, приводя к быстрому снижению pH. Вследствие этого водные растворы формамида следует использовать в первые 15 мин после смешивания. Формамид фирмы Mallincrodt с 99%-ным содержанием можно использовать непосредственно без очистки; реактивы худшего качества предварительно должны очищаться. Чистоту реактива можно определить измерением оптической плотности при 270 нм, которая должна быть Растягивание монослоев проводят в пластмассовых чашках Петри диаметром 50 мм. Во время растягивания чашки фиксируют липкой лентой.
Предметные стекла моют и хранят в хромпике, а перед использованием тщательно промывают дистиллированной или бидистиллированной водой. После использования их ополаскивают водой и кладут опять в хромпик.
Для приготовления сеток, покрытых парлодием, растворяют высушенный в сушильном шкафу при 60°С парлодий (пироксилин, Mallincrodt) в изоамилацетате или амилацетате до концентрации 3,5%. Для лучшего растворения смесь перемешивают, но не встряхивают и затем добавляют в нее поглотители воды. Сетки покры-вают парлодием следующим образом.
а) Помещают на подставку, лежащую на дне перекрытой воронки Бюхнера, решетку из стальной проволоки. Воронку наполняют бидистиллированной водой и укладывают сетки на эту решетку. Для обычной работы подходят медные сетки с размером ячейки 200 меш (Е. F. Fullam, Inc.). Важно, чтобы все сетки были расположены одинаково: все либо матовой, либо блестящей стороной вверх.
б) Очищают водную поверхность, добавляя несколько капель раствора парлодия и удаляя бумагой образовавшуюся пленку, после того как она высохнет.
в) Получают пленку из одной капли раствора парлодия. Накрывают вороику оберточной бумагой Saran и ждут около 3 мин, пока блестящая парлодиевая пленка не образует у краев воронки широкие складки. Медленно спускают воду, чтобы пленка опустилась на сетки. С задней стороны решетки, на которой лежат сетки, убирают избыток воды и кладут ее вместе с покрытыми парлодием сетками в сушильный шкаф с температурой 60 °С на 45 мин. Если пленка приготовлена правильно, она кажется серебристой.
Приводим адреса некоторых поставщиков электронно-микроскопического оборудования и реактивов:
Е. F. Fullam, Inc., Р. О. Box 444, Schenectady, NY 12301(518/785-5533)
Numonics, P. O. Box 444, North Wales, PA 19454 (215/643-7410)
Ted Pella, Inc., P. O. Box 510, Tustin, CA 92680 (714/557-9434)



Источник: zakon.today


Добавить комментарий